Hướng dẫn đọc kết quả định tính bằng phương pháp Real-time PCR

Sau khi việc chạy kết thúc, phân tích dữ liệu như sau bằng cách kiểm tra đường tín hiệu huỳnh quang và Ct của các mẫu theo trình tự sau:

1. Mẫu chứng dương:

Tín hiệu huỳnh quang kênh màu FAM vượt ngưỡng và có giá trị Ct nằm trong khoảng:

1 HBV26.00 ± 1.66 CtE1 HCV30.20 ± 1.66 Ct
E2 HBV22.68 ± 1.66 CtE2 HCV26.70 ± 1.66 Ct
E3 HBV19.36 ± 1.66 CtE3 HCV23.40 ± 1.66 Ct
E4 HBV16.04 ± 1.66 CtE4 HCV20.10 ± 1.66 Ct
E5 HBV12.72 ± 1.66 CtE5 HCV
  1. ± 1.66 Ct

2. Chứng âm PCR:

không có tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng ở kênh màu FAM và HEX

3. Chứng âm tách chiết:

không có tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng ở kênh màu FAM và có giá trị Ct: 28±1.66 ở kênh màu HEX.

4. Đường chuẩn:

Các chuẩn định lượng kèm theo (standard E1-E5) là các mẫu H đã biết trước nồng độ và có cùng thể tích được sử dụng so với mẫu. Đường chuẩn được sử dụng cần đạt các tiêu chí sau:

+ Hệ số góc (slope) nằm trong khoảng: -3.6 đến -3.3, tốt nhất là -3.32

+ Hiệu suất khuếch đại (Efficiency): nằm trong khoảng 90 đến 110%., tốt nhất là 100%.

+ Hệ số R2 lớn hơn 0.980, tốt nhất là gần bằng 1.0

Lưu ý: cần căn chỉnh lại đường nền (baseline) để đạt các tiêu chí tốt nhất, có thể xóa bớt 1,2 điểm chuẩn để đạt giá trị tốt nhất. Nếu đường chuẩn không đạt, cần thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.

5. Mẫu xét nghiệm:

a. Chứng nội của mẫu xét nghiệm:

Tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng ở kênh màu HEX) trong tất cả mẫu xét nghiệm với khoảng giá trị Ct: 28±1.66. Trong vài trường hơp tín hiệu kênh HEX có thể thấp hoặc không có, vì khi nồng độ tác nhân mục tiêu cao (tín hiệu dương tính ở kênh màu FAM) có thể dẫn đến việc giảm hoặc không có tín hiệu huỳnh quang của chứng nội trong kênh màu HEX (cạnh tranh).

b. Mẫu xét nghiệm dưới ngưỡng phát hiện của quy trình:

+ không có tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng ở kênh màu FAM và có giá trị Ct: 28±1.66 ở kênh màu HEX.

+ Tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng ở kênh màu FAM và có giá trị Ct: 28±1.66 ở kênh màu HEX. Tuy nhiên giá trị định lượng (đơn vị IU/mL) nắm dưới ngưỡng phát hiện bộ kit.

Mẫu xét nghiệm dương tính: Tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng ở kênh màu FAM, giá trị định lượng (đơn vị IU/mL) nắm trên ngưỡng phát hiện bộ kit.

Mẫu không hợp lệ: không có tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng ở kênh màu FAM và HEX. Tách chiết hoặc pha loãng để kiểm tra.

6. Tính toán kết quả định lượng:

Hàm lượng DNA HBV trong mix phản ứng dương tính được tính dựa trên đường cong chuẩn xây dựng từ các nồng độ DNA chứng dương ở đơn vị là IU/ml. Do đó cần quy đổi chuyển đổi sang đơn vị IU/mL theo công thức

Trong đó (IU/mL): Nồng độ tác nhân  trong 1mL mẫu.

                 [KQ] (IU/µL): Kết quả xuất ra từ máy

                 V (DNA): Thể tích DNA thu được sau tách chiết (đơn vị µL)

                V (mẫu): Thể tích mẫu sử dụng cho tách chiết (đơn vị mL)

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *