3 ĐIỀU BẠN NÊN BIẾT VỀ PCR KỸ THUẬT SỐ Digital PCR

Cùng TBR tìm hiểu về 3 điều bạn nên biết về PCR kỹ thuật số Digital PCR. Hiện nay, PCR kỹ thuật số Digital PCR phương pháp mang lại mức độ chính xác và khả năng tái tạo cao.

Như chúng ta đã biết, PCR là một phản ứng với khả năng khuếch đại một đoạn trình tự DNA cụ thể thành rất nhiều bản sao của chính nó, nhằm mục đích nhận diện chúng bằng những thí nghiệm như điện di hoặc lai phân tử. Hay cải tiến hơn là Realtime PCR, có thể phát hiện được sự thay đổi về số lượng trình tự mục tiêu ngay trong từng chu kỳ của phản ứng và đồng thời có thể định lượng tương đối được nồng độ trình tự mục tiêu ban đầu.

PCR dựa trên lý thuyết khuếch đại là theo cấp số nhân. Do đó, nucleic acid có thể được định lượng bằng cách thực hiện Realtime PCR, sau đó đối chiếu số chu kỳ khuếch đại và lượng sản phẩm PCR với lượng của mẫu chuẩn tham chiếu. Tuy nhiên, nhiều yếu tố làm phức tạp tính toán này, tạo ra sự không chắc chắn và không chính xác.

Những yếu tố này bao gồm: sự khuếch đại ở những chu kỳ ban đầu có thể không liên tục dẫn đến không khuếch đại theo cấp số nhân; Sự khuếch đại ở một số chu kỳ cuối có thể không ổn định; và nồng độ ban đầu thấp của các phân tử nucleic acid đích có thể không khuếch đại đến mức có thể phát hiện được. Ngoài ra, hạn chế đáng kể nhất của PCR là hiệu quả khuếch đại PCR trong một mẫu quan tâm có thể khác với các mẫu tham chiếu.

Từ những năm 90, các nghiên cứu đã đóng góp nhiều cơ sở để xây dựng nên một kỹ thuật trên nền tảng PCR, với độ chính xác cao hơn nhiều so với PCR truyền thống hay cả Realtime PCR. Và năm 1999, Bert Vogelstein và Kenneth Kinzler đã đặt ra thuật ngữ “Digital PCR” (dPCR) để gọi tên kỹ thuật này.

I. Nguyên lý PCR kỹ thuật số (dPCR)

Về nguyên lý, PCR kỹ thuật số Digital PCR (dPCR) sẽ giống với PCR truyền thống, cùng phản ứng lai hóa các đầu dò để phát hiện mục tiêu qua tín hiệu huỳnh quang. Nhưng để có thể phát hiện được mục tiêu với nồng độ cực kỳ hạn chế, kỹ thuật này cần phải có cách cải thiện độ phân giải của nó. Và vì vậy để bắt đầu quy trình dPCR, trước khi thực hiện phản ứng khuếch đại thì ta phải chia nhỏ một phản ứng gốc thành hàng nghìn phản ứng nhỏ khác thành các giọt với kích thước nano.

Ví dụ như một phản ứng gốc thể tích 16 µL số lượng trình tự mục tiêu chỉ là 2 bản sao trong toàn bộ phản ứng. Sau khi thực hiện chia nhỏ thành 16 phản ứng với thể tích 1 µL, một hỗn hợp phản ứng với nồng độ 2 copies/16 µL đã trở thành 16 hỗn hợp phản ứng, và chắc chắn sẽ có 2 phản ứng trong đó có nồng độ 1 copies/µL, hoặc sẽ có 1 phản ứng có nồng độ 2 copies/µL. Lúc này nồng độ của mục tiêu đã tăng lên 8-16 lần, với nồng độ đó, bộ phận thu nhận tín hiệu có thể dễ dàng nhận thấy được sự thay đổi trong phản ứng hơn nhiều lần so với phản ứng gốc.

Hình 1. Khả năng tăng độ phân giải của phản ứng cũng như hạn chế ảnh hưởng từ chất ức chế của dPCR

Được xây dựng trên nền tảng của kỹ thuật PCR, thêm vào đó dPCR phát hiện sự nhân bản bằng tín hiệu của các chất phát huỳnh quang lai đặc hiệu với trình tự trong quá trình khuếch đại tương tự Realtime PCR. Vậy nên, các thành phần cơ bản trong một phản ứng dPCR cũng sẽ giống như Realtime PCR. Bao gồm: DNA mạch khuôn, Mồi xuôi, Mồi ngược, chất phát huỳnh quang và PCR master mix chứa DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂ và đệm cho phản ứng ở nồng độ tối ưu. Sau khi toàn bộ thành phần đã được bổ sung đầy đủ vào một ống phản ứng gốc, phản ứng sẽ được chia nhỏ với thể tích nanolit và bọc từng phản ứng giọt phản ứng trong các giọt dầu sau đó được bơm toàn bộ vào một ống hay một bể phản ứng, gọi là Droplet Digital PCR (ddPCR). Hay phản ứng gốc có thể được bơm vào một chip nhỏ có cấu tạo bao gồm thành hàng nghìn buồng (chamber) có kích thước nano. Chúng đảm bảo cho các phần nhỏ của phản ứng được chia đều với thể tích siêu nhỏ và tương đương nhau, gọi là Chip Digital PCR (cdPCR). Và số lượng phản ứng được phân chia càng lớn thì năng lực phân biệt của phương pháp càng tốt.

Các hỗn hợp nhỏ này sau đó sẽ được thực hiện cùng một chu trình nhiệt để khuếch đại như PCR thông thường. Cuối cùng khi kết thúc toàn bộ chu trình, thiết bị sẽ thu nhận tín hiệu riêng lẻ trên từng phản ứng nhỏ và mã hóa trên bằng các dạng biểu đồ.

Đối với dPCR định lượng, thuật toán của thiết bị sẽ thực hiện ước lượng nồng độ mục tiêu trong mầu bằng thuật toán thống kê Poisson dựa trên số lượng phản ứng dương tính thu nhận được, với khoảng tin cậy 95%. Và phương pháp định lượng này hoàn toàn không cần đến việc xây dựng đường chuẩn như định lượng bằng Realtime PCR.

II. Thiết bị sử dụng PCR kỹ thuật số dPCR

Dù chỉ mới được phát triển trong khoảng hơn 20 năm trở lại đây, nhưng hiện tại đã có khá nhiều đơn vị sản xuất được các thiết bị dPCR và đưa ra thị trường. Để rõ hơn, chúng ta có thể nhìn qua một ví dụ về thiết bị dPCR Sniper DQ24.DQ24 là một hệ thống ddPCR đến từ Sniper Medical Technology – Trung Quốc. Có khả năng thực hiện một quy trình dPCR khép kín tự động hoàn, từ bước phân phối phản ứng cho đến luân nhiệt và phân tích kết quả.Ứng dụng phương pháp Droplet Digital PCR, hệ thống này cho phép phân chia một phản ứng thành tối đa 40.000 phản ứng nhỏ được bọc trong các giọt dầu. Thay vì thực hiện luân nhiệt trong một tube PCR, các vi phản ứng này sẽ được phân phối nhỏ giọt và trải đều trên một bề mặt phẳng gọi là Reaction Plate. Các Reaction Plate này sẽ được đậy kín sau khi đã phân phối, và thực hiện luân nhiệt để khuếch đại mục tiêu

Hình 2. (A) Các phản ứng gốc được phân phối tự động cùng lúc; (B) Các vi phản ứng được phân chia với thể tích tương đồng nhau, và bơm xuống theo hình zigzag; (C) Các vi phản ứng sẽ được trải đều trên bề mặt Reaction Plate mà không che lấp nhau

Sau khi hoàn tất khuếch đại, hệ thống sẽ thu nhận tín hiệu huỳnh quang giống như trên các thiết bị Realtime PCR. Tuy nhiên tín hiệu thu nhận sẽ là tín hiệu huỳnh quang cuối cù của phản ứng mà không phải là tín hiệu huỳnh quang của từng chu kỳ. Ngoài ra, DQ24 có thể thu nhận và phân tích trên 6 kênh màu, cho khả năng linh hoạt trong các phản ứng multiplex để phát hiện đa tác nhân hiệu quả.

Hình 3. (A) Thiết bị tự động thu nhận tín hiệu sau phản ứng; (B) Mô tả tín hiệu huỳnh quang được thu nhận trên từng vi phản ứng

Dựa trên tín hiệu thô thu nhận trên từng vi phản ứng như Hình 2.(B), chúng ta có thể kiểm soát được chất lượng vi giọt qua phần Droplet QC trên phần mềm phân tích. Đối với kết quả phân tích, phần mềm còn có thể hiển thị dưới dạng các biểu đồ như Scatter Plot, Histogram hay biểu đồ nồng độ mẫu để có thể tối ưu hóa cho việc phân tích kết quả.

Hình 4. Một số dạng biểu đồ kết quả dPCR

III. So sánh dPCR với qPCR

IV. Một số ứng dụng trong y học của dPCR

– Định lượng tuyệt đối.

– Phát hiện đột biến gen.

– Phát hiện trình tự hiếm.

– Đánh giá biểu hiện gen.

Một số ứng dụng của dPCR đã được công bố có thể dễ dàng tím thấy như chẩn đoán các dị tật thai nhi trước sinh; chẩn đoán ung thư; phát hiện và định lượng một số tác nhân gây bệnh truyền nhiễm như vi khuẩn lao, virus viêm gan, HIV, vi khuẩn Lyme,… Các nghiên cứu này đã chứng minh được tiềm năng to lớn của kỹ thuật Digital PCR tới ngành khoa học sự sống trong tương lai sắp tới.