Hệ thống phát hiện huỳnh quang Real-time PCR

1. Hóa chất dùng cho Real-time PCR huỳnh quang:

Hiện nay, có nhiều hệ thống phát hiện huỳnh quang Real-time PCR, nhưng được sử dụng rộng rãi nhất là xét nghiệm 5′ nuclease; trong đó nổi tiếng nhất là Xét nghiệm TaqMan® và xét nghiệm dựa trên thuốc nhuộm SYBR® Green (Hình 1).

Hình 1: Xét nghiệm 5’ nuclease

Xét nghiệm 5’ nuclease được đặt tên theo hoạt động liên kết của 5’ nuclease với Taq DNA polymerase

Hình 2: Minh họa của Taq DNA polymerase. Mỗi màu hình cầu đại diện cho một miền protein.

Miền 5`nuclease có khả năng tách liên kết DNA với khuôn mẫu. Yếu tố quan trọng thứ hai trong xét nghiệm 5’ nuclease là một hiện tượng gọi là FRET: truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang. Trong FRET, lượng phát thải của thuốc nhuộm huỳnh quang có thể bị giảm mạnh khi có sự hiện diện của thuốc nhuộm khác trong một khoảng cách rất gần, thường được gọi là ‘quencher’.

Hình 3: Hiện tượng FRET: (A) FRET xảy ra khi thuốc nhuộm huỳnh quang phát ra ánh sáng màu xanh lá cây ở gần thuốc nhuộm huỳnh quang phát ra ánh sáng đỏ. (B) FRET không xảy ra khi hai thuốc nhuộm huỳnh quang không ở gần nhau

FRET có thể được minh họa bằng hai loại thuốc nhuộm huỳnh quang: xanh lá cây và đỏ. Thuốc nhuộm huỳnh quang màu xanh lá cây có năng lượng phát xạ cao hơn so với màu đỏ, vì ánh sáng xanh lá cây có bước sóng ngắn hơn so với màu đỏ. Nếu thuốc nhuộm màu đỏ ở gần thuốc nhuộm màu xanh lá cây, sự kích thích của thuốc nhuộm màu xanh lá cây sẽ làm cho năng lượng phát xạ màu xanh lá cây được chuyển sang thuốc nhuộm màu đỏ. Nói cách khác, năng lượng đang được chuyển từ mức cao hơn xuống mức thấp hơn. Do đó, tín hiệu từ thuốc nhuộm màu xanh lá cây sẽ bị triệt tiêu hoặc “dập tắt”. Tuy nhiên, nếu hai thuốc nhuộm không ở gần nhau thì FRET không thể xảy ra, cho phép thuốc nhuộm màu xanh phát ra toàn bộ tín hiệu của nó.