1. Digital PCR là gì?

Digital PCR hay PCR kỹ thuật số (dPCR) là phương pháp định lượng tuyệt đối nồng độ Acid Nucleic thông qua sự kết hợp giữa pha loãng giới hạn, PCR điểm cuối và thống kê Poisson.

Máy PCR kỹ thuật số chia phản ứng PCR được tạo thành từ Acid Nucleic khuôn mẫu, mồi, đầu dò, nucleotide, enzyme và buffer thành hàng nghìn phản ứng vi mô. Mỗi phân vùng thực tế không chứa, một hoặc một số phân tử Axit Nucleic mục tiêu. Thiết bị PCR kỹ thuật số khuếch đại các phản ứng vi mô riêng biệt. Vào cuối quy trình khuếch đại, đầu dò huỳnh quang được sử dụng để phát hiện sự có mặt hoặc vắng mặt của sản phẩm trong mỗi phân vùng. Phản ứng dương tính với Acid Nucleic khuôn mẫu sẽ phát ra tín hiệu huỳnh quang, phản ứng âm tính không có Acid Nucleic mục tiêu sẽ vẫn tối

2. Tổng quan về Droplet digital PCR (ddPCR)

2.1. ddPCR kỹ thuật số vi giọt là gì và nguyên lý hoạt động của ddPCR

ddPCR là một dạng dPCR, trong đó phương pháp này sử dụng hệ thống giọt nhũ tương nước-dầu. Hàng nghìn giọt có kích thước nanolit được hình thành trong nhũ tương nước-dầu để tạo thành các phân vùng tách biệt mà trong đó các phân tử acid nucleic khuôn mẫu được phân phối ngẫu nhiên (Hình 1, 2). Công nghệ ddPCR sử dụng thuốc thử tương tự như qPCR. Các giọt về cơ bản có chức năng giống như các ống nghiệm hoặc giếng riêng lẻ trong một đĩa, phản ứng PCR diễn ra trong từng giọt tạo thành.

Hình 1 – Mô phỏng sự phân chia dung dịch thành giọt nhỏ 

Mục tiêu khuếch đại được phát hiện vào cuối quá trình PCR bằng cách đo sự có mặt hoặc không có huỳnh quang của các đầu dò đặc hiệu trình tự hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang chèn.

Sau khi phân tích số lượng phản ứng dương tính và âm tính, số lượng tuyệt đối các phân tử có trong mẫu ban đầu được tính toán bằng cách sử dụng thống kê Poisson (Hình 2).

Không giống như qPCR, dPCR không dựa vào các đường cong chuẩn để định lượng acid nucleic

Hình 2 – Nguyên lý Droplet Digital PCR

2.2. Ưu/ nhược điểm của ddPCR kỹ thuật số vi giọt 

Ưu điểm của ddPCR kỹ thuật số vi giọt 

• Định lượng mục tiêu đơn giản hóa và tuyệt đối – cung cấp số lượng tuyệt đối các bản sao DNA mục tiêu trên mỗi mẫu đầu vào mà không cần chạy đường cong tham chiếu hay đường chuẩn
• Khả năng chịu đựng chất ức chế cao – Nhờ phân vùng và đo điểm cuối, hiệu quả dPCR không bị ảnh hưởng bởi chất ức chế PCR.
• Độ chính xác cao – Phân vùng trong PCR kỹ thuật số tạo ra hàng nghìn điểm dữ liệu và kết quả chính xác hơn vào cuối quá trình khuếch đại, giúp phân tích dPCR kỹ thuật số phù hợp để phát hiện những thay đổi nhỏ về số lượng bản sao trình tự mục tiêu giữa các mẫu.
• Độ nhạy được cải thiện – hệ thống dPCR kỹ thuật số cung cấp giới hạn phát hiện (LOD) được cải thiện vì thể tích phản ứng nhỏ hơn làm tăng nồng độ hiệu quả của acid nucleic mục tiêu.
• Khả năng tái tạo cao – phân tích ddPCR kỹ thuật số vẫn có thể lặp lại được ở nhiều phòng thí nghiệm vì độ lệch hiệu quả khuếch đại được giảm đáng kể.
• Hiệu quả về chi phí – Khối lượng mẫu và thuốc thử được giữ ở mức tối thiểu, giúp giảm chi phí thử nghiệm; khả năng ghép kênh cho phép tăng thông lượng và năng suất.

Nhược điểm của ddPCR kỹ thuật số vi giọt 

• Phạm vi động hẹp – Số lượng đơn vị trong thiết bị ddPCR bị hạn chế nên phạm vi số lượng bản sao DNA/RNA có thể được phát hiện có xu hướng hẹp hơn so với qPCR.
• Amplicon lớn – dPCR không phù hợp để phân tích các amplicon rất lớn

2.3. Một số ứng dụng của ddPCR kỹ thuật số vi giọt

Sinh thiết lỏng:

Sinh thiết lỏng là xét nghiệm không xâm lấn có khả năng phát hiện tế bào tế bào khối u lưu thông (circulating tumour cells – CTC) hoặc DNA thải ra từ khối u (circulating tumor DNA – ctDNA) trong máu.

Một loạt các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ddPCR có thể được sử dụng để sinh thiết lỏng, thường có độ nhạy cao hơn các kỹ thuật khác. MACC1 và S100A4 được phát hiện trong huyết thanh lưu hành của bệnh nhân ung thư buồng trứng. So với nhóm đối chứng khỏe mạnh, MACC1 và S100A4 trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư buồng trứng tăng đáng kể. Khi chẩn đoán, nồng độ MACC1 hoặc S100A4 cao có tương quan với giai đoạn tiến triển của ung thư, do đó có thể được sử dụng để dự đoán thời gian sống không tiến triển và chỉ báo về mức độ hiệu quả của một phương pháp điều trị

Phát hiện trình tự hiếm:

ddPCR cho phép tăng hiệu suất phát hiện và định lượng các trình tự hiếm vì định lượng mục tiêu không phụ thuộc vào số chu kỳ khuếch đại.

Hầu hết những người mắc HBV mãn tính không có triệu chứng; tuy nhiên, một số có thể dẫn đến xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan cuối cùng nên chẩn đoán đáng tin cậy về tình trạng nhiễm HBV ban đầu có thể ngăn ngừa bệnh nhân khỏi tình trạng xấu đi một cách hiệu quả.

Kháng nguyên bề mặt viêm gan B là kháng nguyên virus đầu tiên có thể phát hiện được trong quá trình nhiễm HBV, nhưng nó có thể xuất hiện rất ít trong giai đoạn đầu, vì vậy cần có một nền tảng mới, nhạy cảm và đặc hiệu hơn để cải thiện khả năng phát hiện HBV.

Một nghiên cứu cho thấy rằng so với PCR định lượng thông thường cần ít nhất hơn 102 copies cccDNA hoặc HBV DNA, ddPCR chỉ cần 0,54 đến 0,594 copies cccDNA để phát hiện HBV chính xác

Biểu hiện gen:

ddPCR cho phép định lượng chính xác những thay đổi nhỏ hơn trong mức độ biểu hiện và cung cấp độ nhạy cao hơn khi định lượng các mục tiêu hiếm hoặc RNA từ vật liệu rất hạn chế. Những thai nhi mắc hội chứng Down có biểu hiện mRNA PLAC4 và tỉ lệ đột biến đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorphisms – SNP) cao hơn nhóm đối chứng. dPCR được sử dụng để định lượng biểu hiện của các SNP và mRNA PLAC4 trong cffDNA (chiếm rất ít trong huyết tương người mẹ), với độ nhạy là 100% và độ đặc hiệu là 89%

Giải pháp kiểm tra nước thải:

Việc xét nghiệm và giám sát nước thải đã mở ra nhiều khả năng cho các nhà nghiên cứu phân tích chính xác sự lưu thông của nhiều tác nhân gây bệnh và do đó cải thiện về sức khỏe cộng đồng. Với việc sử dụng rộng rãi kháng sinh carbapenem, các báo cáo lâm sàng về các bệnh nhiễm trùng liên quan đến Enterobacteria kháng carbapenem (CRE) đã tăng lên.

Giám sát nước thải có khả năng bổ sung cho giám sát lâm sàng về CRE và giám sát kháng kháng sinh (AR) ở cấp độ quần thể nói chung. Xét nghiệm ddPCR nhắm vào năm gen mã hóa carbapenemase được áp dụng cho các mẫu nước thải từ ba địa điểm trong hơn 12 tuần. Kết quả cho thấy về sự phong phú của vi khuẩn kháng thuốc và gen kháng carbapenem chiếm ưu thế

Phát hiện mầm bệnh và phân tích hệ vi sinh vật:

Cả phát hiện tác nhân gây bệnh và phân tích hệ vi sinh vật thường đòi hỏi phải định tính và định lượng các vi sinh vật có số lượng thấp trong nền phức tạp. Bệnh lao (TB) do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis (MTB) gây ra. Bệnh sẽ không có triệu chứng trong giai đoạn đầu nhiễm trùng, trong trường hợp này được gọi là bệnh lao tiềm ẩn. Khoảng 10% các bệnh nhiễm trùng tiềm ẩn tiến triển thành bệnh hoạt động, nếu không được điều trị, tỷ lệ tử vong là 50%.

Nhiều lần nuôi cấy đờm để tìm trực khuẩn kháng acid thường là một phần của đánh giá ban đầu; tuy nhiên, sinh vật phát triển chậm này luôn mất 2–6 tuần để nuôi cấy máu hoặc đờm. Vì vậy, định lượng DNA của Mycobacterium tuberculosis bằng PCR là một phương pháp hiệu quả để chẩn đoán bệnh lao.

Tuy nhiên, khó có thể lấy đủ mẫu của một số bệnh nhân đặc biệt, chẳng hạn như bệnh nhân lao ngoài phổi không có tổn thương đường hô hấp, trẻ sơ sinh hoặc trẻ em. Hiện nay, chúng ta có thể phát hiện các đoạn DNA đặc hiệu MTB trong các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân lao bằng ddPCR với độ nhanh và chính xác hơn

Giải trình tự thế hệ mới (NGS):

ddPCR có thể tăng hiệu quả và độ chính xác của NGS, tiết kiệm cả tiền bạc và thời gian. Việc kiểm tra sinh thiết lỏng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng (CRCs) để xác định đột biến kháng thuốc. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng ddPCR để kiểm tra trạng thái đột biến của 7 gen quan trọng trong sự phát triển và kháng CRC.

Theo dõi ctDNA các đột biến kháng thuốc sẽ giúp chúng ta xác định phương pháp điều trị cho bệnh nhân CRC. Tuy nhiên, khi không thể dự đoán được các đột biến kháng thuốc, NGS là cần thiết để đưa ra cái nhìn toàn cảnh về gen và xác định những đột biến mới quan trọng định hướng sự phát triển của ung thư. ddPCR cho phép theo dõi những đột biến với độ nhạy cao bổ sung cái nhìn chi tiết cho NGS

Xét nghiệm trước sinh không xâm lấn:

Năm 1997, cell-free fetal DNA (cffDNA) được phát hiện trong huyết tương của mẹ ở mức độ cực kì thấp (chỉ chiếm 10-20% tổng số protein huyết tương), nhưng cũng báo hiệu một kỷ nguyên mới của xét nghiệm trước sinh không xâm lấn (NIPT).

Với ddPCR, cffDNA có thể được định lượng chính xác, qua đó có thể dự đoán trước các bệnh di truyền thông qua các gen mục tiêu. Thai nhi được chẩn đoán mắc bệnh hồng cầu hình liềm (SCD) bằng dPCR thông qua DYS14, dấu hiệu đặc hiệu của nhiễm sắc thể Y với thai nhi nam hoặc một nhóm các dấu hiệu đa hình trong DNA ở thai nhi nữ

2.4. ddPCR trong chẩn đoán ung thư

Ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ hai trên toàn cầu, ước tính gây ra 9,6 triệu ca tử vong vào năm 2018. Gánh nặng ung thư tiếp tục gia tăng trên toàn cầu, gây ra gánh nặng về thể chất, cảm xúc và tài chính to lớn cho cá nhân, gia đình, cộng đồng và hệ thống y tế. Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót của nhiều loại ung thư được cải thiện nhờ phát hiện sớm, điều trị chất lượng và chăm sóc người sống sót

Nghiên cứu và chẩn đoán ung thư là một trong những ứng dụng quan trọng của sinh thiết lỏng. Mục tiêu của sinh thiết lỏng là phát hiện và định lượng các cfDNA, ctDNA và CTC có mang đột biến lưu hành trong máu. Tuy nhiên những trình tự đích này thường hiện diện ở mức thấp và xung quanh chúng còn có các thành phần phức tạp khác như tế bào bạch cầu, DNA bình thường từ các tế bào già yếu của cơ thể, …

Ngoài ra, DNA tuần hoàn thường bị phân mảnh cao, nên hàm lượng trình tự đích còn nguyên vẹn cũng sẽ không cao. Những thách thức này đòi hỏi các kỹ thuật sàng lọc đột biến cần có độ nhạy cao hơn để có thể phát hiện và định lượng các trình tự đích có hàm lượng thấp trong thời gian ngắn. ddPCR là công cụ phù hợp cho sinh thiết lỏng. Đây là công nghệ mới, cho phép định lượng tuyệt đối các trình tự đích với độ nhạy và độ chính xác cao

Trong khối phụ khoa 

Ung thư vú xâm lấn:

HER2 một yếu tố tăng trưởng biểu bì ở người. Và nếu protein HER2 hiện diện với số lượng lớn sẽ báo hiệu ung thư vú phát triển và di căn nhanh hơn. ddPCR có thể phát hiện số lượng bản sao tuyệt đối của gen mã hóa HER2 trong ung thư vú xâm lấn giúp chẩn đoán và áp dụng các liệu pháp điều trị phù hợp cho bệnh nhân.

Ung thư vú dương tính với HR (hormone receptor-positive)

ddPCR chủ yếu được sử dụng để đánh giá khả năng kháng thuốc trong liệu pháp nội tiết (endocrine therapy – ET) cho căn bệnh này. Ung thư có thể trở nên kháng với các tác nhân estrogen được sử dụng nhiều lần trong ET. Các đột biến kích hoạt thụ thể estrogen 1 (ESR1) được phát hiện ở lượng cfDNA (cell-free DNA) cực thấp liên quan đến khả năng kháng ET.

Ung thư vú bộ ba âm tính (triple negative breast cancer – TNBCs)

Sử dụng ddPCR để phân tích tần suất đột biến của PIK3CA trong ctDNA có liên quan đến vấn đề kháng thuốc, xuất hiện ở 20-40% ung thư vú, có giá trị lớn trong việc khám phá tác động của nó lên tiên lượng TNBCs.

Ung thư cổ tử cung

Phát hiện CTC ở bệnh nhân ung thư có thể được sử dụng để đánh giá hiệu quả của liệu pháp và dự đoán sự tái phát của ung thư. Một xét nghiệm nhạy cảm dựa trên bản sao HPV-oncogene có độ đặc hiệu cao đối với tế bào ung thư cổ tử cung đã được thiết lập. ddPCR cho phép phân tích trực tiếp và phát hiện từng CTC mà không cần phân lập RNA. Các mẫu thử nghiệm đã chứng minh độ nhạy của một tế bào dương tính với HPV trong 500.000 tế bào âm tính với HPV.

Ung thư khác 

Ung thư phổi không tế bào nhỏ (non-small cell lung cancer – NSCLC

NSCLC là dạng ung thư phổi phổ biến nhất. NSCLC mang những đột biến hoạt hóa thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) và đáp ứng với các thuốc ức chế tyrosine kinase. Có nhiều đột biến hoạt hóa EGFR khác nhau, và sau một thời gian điều trị, phần lớn các NSCLC trở nên kháng lại với thuốc ức chế kinase. Hiện tượng kháng thuốc này được gây ra chủ yếu bởi đột biến thứ cấp EGFRT790M. Chính vì vậy, ngoài việc xác định những đột biến EGFR, hiện nay các bác sĩ cho rằng cần kiểm tra sự xuất hiện của những đột biến thứ cấp trong quá trình điều trị. dPCR được ứng dụng để phân tích ctDNA và còn cho phép phát hiện đột biến thứ cấp EGFRT790M ở tỷ lệ thấp trước khi khối u phát triển trở lại do hiện tượng kháng với các chất ức chế tyrosine kinase.

Ung thư da ác tính

Khoảng 50% các khối ung thư da ác tính có mang đột biến chuyển đổi valine thành glutamic acid tại codon 600 của serine/threonine kinase B-Raf (một loại gen tiền ung thư). Những bệnh nhân mang đột biến (BRAFV600E) này được điều trị bằng thuốc ức chế BRAF. Sự tăng mức độ ctDNA BRAFV600E sẽ là dấu hiệu của hiện tượng kháng với phương pháp điều trị. Mức độ cfDNA lưu hành trong máu có chứa đột biến này rất thấp (<0,01% của cfDNA). dPCR đã được ứng dụng để phát hiện đột biến BRAFV600E nhằm xác định những bệnh nhân có khả năng đáp ứng với phương pháp điều trị bằng thuốc ức chế BRAF cũng như theo dõi quá trình điều trị sau đó.

3. Hệ thống phân tích ddPCR

Hệ thống phân tích Droplet Chip Digital PCR – DigitalGene 1600 của Bioer là hệ thống duy nhất có công nghệ tạo giọt dựa trên ly tâm, hội tụ đầy đủ các ưu điểm và tính năng nổi trội của công nghệ ddPCR với nhiều ứng dụng nổi bật

• Sinh thiết lỏng các markers khối u
• Chẩn đoán đồng hành
• Chẩn đoán trước sinh không xâm lấn
• Phát hiện bệnh truyền nhiễm
• Giám sát vi sinh môi trường
• Kiểm tra thực phẩm

Các thông số kỹ thuật:

Hệ thống gồm 3 thiết bị: thiết bị tạo giọt, PCR và máy đọc tín hiệu. Hệ thống có các thông số kĩ thuật như sau:

Xem thêm thông tin giải pháp: Hệ thống phân tích PCR kỹ thuật số chip nhỏ giọt hãng Bioer (FDD-16A)